免疫组化是一种重要的医学检测技术，在疾病诊断、研究等方面有着广泛应用。其步骤严谨且关键，每一步都影响着最终的检测结果。下面将详细介绍免疫组化的具体步骤。
样本制备是免疫组化的起始步骤，至关重要。首先要获取合适的组织样本，可通过手术切除、穿刺活检等方式。对于获取到的新鲜组织样本，需立即进行固定处理，常用的固定液是甲醛，它能使组织保持生前的形态结构，防止组织自溶和腐败。固定时间要根据组织大小和性质而定，一般为 24 小时左右。之后进行脱水处理，通过梯度酒精逐步去除组织中的水分，使组织便于透明和浸蜡。接着用透明剂处理组织，使其变得透明，有利于石蜡的浸入。最后将组织包埋在石蜡中，制成石蜡块，以便后续切片。切片厚度通常在 4-6 微米，要保证切片完整、无褶皱，这样才能为后续的免疫组化反应提供良好的基础。
脱蜡水化是为了使组织中的抗原能够充分暴露，便于与抗体结合。将切好的石蜡切片放置在载玻片上，先放入二甲苯中进行脱蜡处理，一般需要更换 2-3 次二甲苯，每次 5-10 分钟，以确保石蜡完全去除。然后通过梯度酒精进行水化，从高浓度酒精到低浓度酒精，最后用蒸馏水冲洗，使组织恢复到含水状态。在这个过程中，要严格按照酒精浓度梯度进行操作，否则会影响组织的形态和抗原的暴露。脱蜡水化不彻底会导致抗体无法与抗原有效结合，从而影响免疫组化的结果准确性。
在组织固定过程中，抗原可能会被封闭或变性，因此需要进行抗原修复。常见的抗原修复方法有热修复和酶消化修复。热修复是将切片放入抗原修复液中，通过微波炉、高压锅等加热设备进行加热，使抗原表位重新暴露。加热时间和温度要根据组织类型和抗原的性质来调整，一般加热至沸腾后再保持一段时间。酶消化修复则是用特定的酶对组织进行消化，使抗原暴露。选择合适的抗原修复方法对于提高免疫组化的敏感性和特异性非常重要。如果抗原修复不当，可能会导致假阴性或假阳性结果。
组织中可能存在内源性过氧化物酶，会与后续加入的酶底物发生反应，产生非特异性染色，影响结果的判断。因此需要封闭内源性过氧化物酶。常用的封闭剂是过氧化氢溶液，将切片浸泡在一定浓度的过氧化氢溶液中，一般为 3%的过氧化氢，处理 10-15 分钟。在处理过程中要注意避免切片干燥，否则会影响封闭效果。封闭内源性过氧化物酶可以有效减少非特异性染色，提高免疫组化结果的准确性。
这是免疫组化的核心步骤。首先加入一抗，一抗能特异性地识别目标抗原。一抗孵育的时间和温度要根据抗体的说明书进行操作，一般在 37℃孵育 1-2 小时或 4℃过夜。孵育后用缓冲液冲洗切片，去除未结合的一抗。然后加入二抗，二抗能与一抗结合，并带有可检测的标记物，如酶或荧光物质。二抗孵育时间一般为 37℃孵育 30 分钟左右。再次用缓冲液冲洗后，加入显色底物，根据标记物的不同选择合适的显色剂。显色过程要密切观察，达到理想的显色效果后及时终止反应。最后用苏木精进行复染，使细胞核着色，便于在显微镜下观察结果。